意大利贵宾

一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究卵白质相互作用的经典要领。。。。是确定两种卵白质在完整细胞内心理性相互作用的有用要领。。。。

其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，
，，，完整细胞内保存的许多卵白质－卵白质间的相互作用被保存了下来。。。。若是用卵白质X的抗体免疫沉淀X，
，，，那么与X在体内连系的卵白质Y也能沉淀下来。。。。

现在多用精制的prorein A预先连系固化在argarose的beads上，
，，，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，
，，，beads上的prorein A就能吸附抗原抵达精制的目的。。。。这种要领常用于测定两种目的卵白质是否在体内连系；；；；；也可用于确定一种特定卵白质的新的作用同伴。。。。

其优点为：

（1）相互作用的卵白质都是经翻译后修饰的，
，，，处于自然状态；；；；；

（2）卵白的相互作用是在自然状态下举行的，
，，，可以阻止人为的影响；；；；；

（3）可以疏散获得自然状态的相互作用卵白复合物。。。。

弱点为：

（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的卵白质－卵白质相互作用；；；；；

（2）两种卵白质的连系可能不是直接连系，
，，，而可能有圈外人在中心起桥梁作用；；；；；

（3）必需在实验前展望目的卵白是什么，
，，，以选择最后检测的抗体，
，，，以是，
，，，若展望不准确，
，，，实验就得不到效果，
，，，要领自己具有冒险性。。。。

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二、准备事情：

预冷PBS，
，，，RIPA Buffer，
，，，细胞刮子（用保鲜膜包好后，
，，，埋冰下），
，，，离心机

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1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，
，，，最后一次吸干PBS；；；；；

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2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm作育皿或150cm2作育瓶，
，，，0.5ml/5×106个细胞、6cm作育皿、75cm2作育瓶)

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3. 用预冷的细胞刮子将细胞从作育皿或作育瓶上刮下，
，，，把悬液转到1.5EP管中，
，，，4℃，
，，，缓慢晃动15min（EP管插冰上，
，，，置水平摇床上）

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4. 4℃，
，，，14000g离心15min，
，，，连忙将上清液转移到一个新的离心管中

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5. 准备Protein A agarose，
，，，用PBS 洗两遍珠子，
，，，然后用PBS配制成50%浓度，
，，，建议剪掉移液器吸头，
，，，尖头部分，
，，，阻止在涉及琼脂糖珠的操作中破损琼脂糖珠

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6. 每1ml总卵白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），
，，，4℃摇晃10min（EP管插冰上，
，，，置水平摇床上），
，，，以去除非特异性杂卵白，
，，，降低配景

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7. 4℃，
，，，14000g离心15min，
，，，将上清转移到一个新的离心管中，
，，，去除Protein A珠子

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8. (Bradford 法)做卵白标准曲线，
，，，测定卵白浓度，
，，，测前将总卵白至少稀释1：10倍以上，
，，，以镌汰细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，
，，，分装后，
，，，可以在-20℃生涯一个月）

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9. 用PBS将总卵白稀释到约1 μg/μl，
，，，以降低裂解液中去垢剂的浓度，
，，，若是诱饵卵白在细胞中含量较低，
，，，则总卵白浓度应该稍高（如10 μg/μl）

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10. 加入一定体积的兔抗到500μl总卵白中，
，，，抗体的稀释比例因诱饵卵白在差别细胞系中的几多而异

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11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混淆物住宿或室温2h，
，，，激酶或磷酸酯酶活性剖析建议用2 h室温孵育

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12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕获抗原抗体复合物，
，，，4℃缓慢摇动抗原抗体混淆物住宿或室温1h，
，，，若是所用抗体为鼠抗或鸡抗，
，，，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，
，，，兔抗鸡IgG）

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13. 14000rpm瞬时离心5s，
，，，网络琼脂糖珠-抗原抗体复合物，
，，，去上清，
，，，用预冷的RIPA buffer洗3遍，
，，，800μl/遍，
，，，RIPA buffer有时间会破损琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的连系，
，，，可以使用PBS

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14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，
，，，轻轻混匀，
，，，缓冲液的量依据上样几多的需要而定（60 μl足够上三道）

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15. 将上样样品煮5min，
，，，以游离抗原，
，，，抗体，
，，，珠子，
，，，离心，
，，，将上清电泳，
，，，网络剩余琼脂糖珠，
，，，上清也可以暂时冻-20℃，
，，，留待以后电泳，
，，，电泳前应再次煮5min变性。。。。

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RIPA Buffer配制：

RIPA卵白酶抑制剂

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事情液配制：

配制100ml的modified RIPA buffe：

1. 称取790mg 的Tris-Base，
，，，加到75ml 去离子水中，
，，，加入900mg的NaCl，
，，，搅拌，
，，，直到所有消融，
，，，用HCl调理PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，
，，，搅拌，
，，，直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA，
，，，用量筒定容到100ml，
，，，2-8℃生涯

5. 理论上，
，，，卵白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑卵白酶肽，
，，，亮抑酶肽,胃卵白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl），
，，，可是PMSF在水溶液中很不稳固，
，，，30分钟就会降解一半，
，，，以是PMSF应该在使用前现加，
，，，其他抑制剂因素可以在水溶液中稳固5天。。。。

RIPA卵白酶抑制剂种种因素在事情液中的终浓度：

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三、实验流程为：

（1）转染后24-48 h 可收获细胞，
，，，加入适量细胞裂解缓冲液（含卵白酶抑制剂），
，，，冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C，
，，，最大转速离心30 min后取上清；；；；；

（2）取少量裂解液以备Western blot剖析，
，，，剩余裂解液加1μg响应的抗体加入到细胞裂解液，
，，，4°C缓慢摇晃孵育住宿；；；；；

（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，
，，，用适量裂解缓冲液洗3 次，
，，，每次3,000 rpm离心3 min；；；；；

（4）将预处置惩罚过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育住宿的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，
，，，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；；；；；

（5）免疫沉淀反应后，
，，，在4°C 以3,000 rpm 速率离心3 min，
，，，将琼脂糖珠离心至管底；；；；；将上清小心吸去，
，，，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；；；；；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，
，，，滚水煮5分钟；；；；；

（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪剖析。。。。通过免疫共沉淀确定连系卵白

1．用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm作育板上的相宜细胞。。。。刮去每块板上的细胞到1 ml酷寒的EBC裂解缓冲液中。。。。

2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，
，，，在微量离心机上4℃以最大速率离心15 min。。。。

3．网络上清（约30 ml）并加入30μg的适当抗体，
，，，4℃摇动免疫沉淀物1 h。。。。

4．加入0.9 ml的卵白质A-Sepharose 悬液，
，，，4℃摇动免疫沉淀物30 min。。。。

5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗卵白A-Sepharose混淆物，
，，，再重复洗5次。。。。最后，
，，，用NETN洗一次。。。。

6．吸出混淆物的液体部分。。。。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，
，，，煮沸4 min。。。。

7．将样品加入到大孔的不一连SDS-PAGE梯度胶中，
，，，在10 mA的恒定电流下电泳住宿。。。。

8．通过考马斯蓝染色视察卵白质泳带。。。。

9．从胶上切下目的带，
，，，将其放到微量离心管中，
，，，用1ml 50%乙腈洗两次，
，，，每次3 min。。。。

10． 用胰卵白酶消化胶中的卵白质，
，，，再将肽电洗脱。。。。

11． 通过窄孔高效液相色谱疏散肽。。。。将网络的肽在ABI 477A或494A机械上举行自动Edman降解测序。。。。

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四、注重的问题：

（1）细胞裂解接纳温顺的裂解条件，
，，，不可破损细胞内保存的所有卵白质－卵白质相互作用，
，，，多接纳非离子变性剂（NP40 或Triton X-100)。。。。每种细胞的裂解条件是纷歧样的，
，，，通过履历确定。。。。不可用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，
，，，细胞裂解液中要加种种酶抑制剂，
，，，如商品化的 cocktailer。。。。

（2）使用明确的抗体，
，，，可以将几种抗体配合使用

（3）使用比照抗体：

单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体：正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要包管实验效果的真实性，
，，，应注重以下几点：

(1) 确保共沉淀的卵白是由所加入的抗体沉淀获得的，
，，，而并非外源非特异卵白，
，，，单克隆抗体的使用有助于阻止污染的爆发；；；；；

(2) 要确？？固宓奶匾煨，
，，，即在不表达抗原的细胞消融物中添加抗体后不会引起共沉淀；；；；；

(3) 确定卵白间的相互作用是爆发在细胞中，
，，，而不是由于细胞的消融才爆发的，
，，，这需要举行卵白质的定位来确定。。。。

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关于CoIP 的比照组怎么设置，
，，，可以在Openi?这个网站中直接搜索「CoIP」论文里的图片，
，，，看看先进们怎么做的就知道该怎样设置比照了

接下来就凭证实验既定流程走就行了，
，，，最后实验效果我们用几篇文章的效果来举例：

有了这样的效果，
，，，文章层次一下子就上去了。。。。